2.1 トランスフェクションアレイデータの解析法の研究

　生命活動は、常に変化する連続的な現象である。これを理解し応用するためには、連続的な時間発展の観測、解析が重要である。これまでそういった観点の観察は個体レベルで行われてきたが、生きた細胞の内部での遺伝子発現量の観測を続けられるトランスフェクション・アレイ（またはセルアレイ、以下ＴＦＡ） [Ziauddin01] が開発され、分子生物学においても定量的な経時変化を観測できるようになってきた。現在非常に広く用いられているＤＮＡマイクロアレイでは、細胞を破壊し測定対象であるｍＲＮＡが細胞質と混合されるため、その量を正しく観測できているか、確かではない。またある時刻でのスナップショットを観測する手法であるため、時系列の観測には大きなコストがかかっていたが、ＴＦＡを用いることでこれらを解決することができる。

　ＴＦＡでは直接の観察結果として、時間間隔をおいて断続的に撮影した画像が得られる。これらは次々と表示することでアニメーションのように見ることができるような性質のものである。１枚の画像はガラス基板（チップ）上に複数あるスポットのうちの一つの、ある時刻での写真であり、各スポットでは、そのスポットに割り当てられた特定のベクターを導入された一個あるいは複数の細胞が培養されている。スポットごとに異なったベクターを導入し、一つのチップ上という同じ環境で培養を行うことで、その環境下での複数の遺伝子の発現量の変化を同時に観察することができる。この培養系、撮影のための光学系、画像を保存し発現量を計算する保存系までは、観測装置として開発された。ここでの報告は発現量データの解析に関する研究についてである。研究は、時系列データから遺伝子相互間の依存関係（遺伝子ネットワーク）の推定を行うことを目指して行った。

　開発した解析法は、ノイズ処理部、クラスタリング部、ネットワーク推定部の三部からなる。それぞれが完全に自動化され、ｗｅｂを通じてデータを送付するだけで解析結果を得られる統合システムを構築した。

2.1.1 ノイズ処理部

ここで

2.1.2 クラスタリング部

　クラスタリングには非常に多くの方法が研究されているが、発現解析でもっとも広く用いられているのは、単純な相関係数による階層的クラスタリングである。この手法は計算処理と解釈が簡明であるという利点の一方で、どの程度近いものを同じクラスタとみなすか、を示す閾値を経験的に設定しなければならない。これに統計モデルを使う方法も考えられるが、処理と解釈の簡明さを保つために、非常に簡潔な指標を用い、それを最大化するように閾値を決定する方法を実装し、完全に自動化されたシステムを構築した。

　一つの遺伝子の発現時系列は一つの実数ベクトルである。このシステムでは全ての遺伝子の組み合わせてについて相関係数を計算し、相関係数の大きなペアからクラスタに属していくという階層クラスタリングを行う。良く行われる方法では、ある相関係数が閾値以下のペアは同じくラスタには属さないという規準を用いるが、ここでは任意性を排除しながら高速な全自動処理を行うため、以下の式を最大化するようにクラスタ数を決定する[Polikli03]。

2.1.3 ネットワーク推定部

　観測された時系列だけから、遺伝子の制御関係を決定することは、一般にはできない。しかし、変化の起こった時刻が遅いものは、早く変化したものの影響を受けている可能性があると言うことはできる。そこで、各遺伝子の多項式近似曲線の微分係数、二階微分係数を使って変化の時刻を決め、その前後関係をもって制御ネットワークの推定構造とするシステムを構築した。微分係数および二階微分係数の各時刻における値は多項式から求められるが、多項式の次数に上限を設けないため、微分係数および二階微分係数の零点は、全時刻にわたる全探索で決定する。これにより得られる制御列に、細胞内の制御カスケードが含まれている可能性があり、全ての遺伝子ペア間の制御関係の有無を調べることなく、遺伝子の個数と同数程度の関係にまで候補を絞ることができる。

　以上の３つのシステムを統合したシステムを開発し、現在ｗｅｂ上の以下のＵＲＬで試験的に運用している。

http://seqx01.cbrc.jp/clarinets/

このシステムでは、共同研究で得られたデータの他に、公開データベースであるＧＥＯ (Gene Expression Omnibus)[GEO] のデータを直接解析できる機能を備えているが、遺伝子発現時系列に関してはいまだ標準データ形式がなく、現実にはGEOのデータも全て解析できるわけではない。標準データ形式の提案と普及、それを集積するデータベースの設置が急務である。

　

2.2 生体内ネットワークの定量的連続時間モデルの最適化法の研究

　遺伝子数５のモデルネットワークを用いてシミュレーションにより時系列データを用意し、そこからモデルネットワークの同定が行えるかどうかのケーススタディを行った。この場合のS-systemのパラメータ数は６０であり、このうちの３０個を最適化対象とした。したがってこの問題は３０次元実数空間での非線形関数最適化となる。スケールフリー性の有効性を検証するため、制限を行う場合と行わない場合とで比較し、スケールフリー性の仮定を行うことで、得られた構造を元のモデルネットワークと比べたときのFalse positive、False negativeともに減らすことができ、が構造推定に有効であることを確認した。

探索空間から二つのパラメータを選んだときの評価関数のプロット。値が零（実行可能解でない）の領域が広く、初期探索点の生成が簡単ではないことを示す。

遺伝子間の相関が２５カ所ある遺伝子数５のネットワークでの制約の有無による構造推定能力の比較結果。1: 制約なし、2: 相関の数のみの制約、3: スケールフリー性維持。a: 探索の収束率、b: 平均世代交代回数、c: False Positive、d: False Negative。Falseと収束率にトレードオフが見られる。

 

2.3 ＤＮＡマイクロアレイ定量時系列データ解析法の研究

　現在、現実に得られる時系列データは、公開、非公開を問わず、ほとんどがＤＮＡマイクロアレイによるものである。コストが年々下がっていることからこの方法による時系列データは今後も増え続けると考え、共同研究としてデータの提供を受け、その解析法の開発を行った。

　ＴＦＡデータと比べたときのマイクロアレイデータの大きな特徴は、観測時点数が少ないことと、定量性が低いことである。現在ＲＩＣＥで開発中のＴＦＡ装置では数百から数千点の時刻で撮影を行うことができるが、マイクロアレイではコストの問題から、２０点程度以上の例は少ない。また定量性が低いことから、多項式近似などで微分係数の零点を決定するなどの操作も信頼性が低く、本来実験条件にしたがって決めるべきである、遺伝子ごとの発現量の統計的性質を調べることも、時間的な制約から行われないことが多い。１枚のチップ全体に関する標準偏差などをアレイのメーカーで把握している程度であり、ばらつきは全て正規分布として処理を行うのが通例である。

　ここでは、概日周期変動を示す遺伝子を探し出すことを目的として解析法を開発した。遺伝子数が約１万の単色マイクロアレイを各時刻で１枚使って約１０点観測したデータ（１万次元のベクトル約１０本）を想定した。各アレイでの発現量ベクトルの平均と分散が等しくなるようにｚ変換を行ったデータを解析対象とした。

　医療的な研究でもっともよく用いられる時系列解析手段はコサイナー法である。これは三角関数を観測データに最小二乗近似する方法であり、最良近似曲線の持つ周期が２４時間近辺であれば、それを概日周期変動とみなす。また自己相関解析（ＡＲモデル）、フーリエ変換も用いられる。ＡＲモデルでは現在の値を過去の値の線形結合で近似する方法で、どのくらい過去の値ともっとも相関が高いかを見ることで周期を調べる。フーリエ変換では、変換後のスペクトルが極大値を取る周期を見ればよい。しかし既存の方法はいずれも、「どの程度合っていればよいか」「どの程度値が高ければよいか」の判断基準は経験的に決定せねばならない。

　そこで、判断基準に情報量規準を導入することで判断の自動化を図った。時系列データを多項式近似する際に、多項式の次数をＡＩＣを使って決定する方法は確立されているので、多項式の代わりにフーリエ変換を用いる方法を開発した。ＡＲモデルにも同様に適用することができる。マイクロアレイにより観察されたある遺伝子の発現時系列をフーリエ変換すると、データの観測範囲の整数分の一に対応する周期に、複素係数ベクトルが得られる。これをそのまま逆変換すると元の時系列が得られるが、一部を零にして逆変換すると元の時系列に似た、あるいは似ていない時系列が得られる。多くの係数が零になった係数ベクトルはシンプルな良いモデルである、モデルを記述するパラメータ数は零でない係数の個数であると考えると、その個数と得られた時系列と元の時系列との差から情報量規準を計算することができる。情報量規準を最小化するように零にする係数を選んだとき、２４時間に対応する係数が零になっていなければ、元の時系列は概日周期変動を示す、と判断する。これにより経験的な閾値などを決める必要がなくなり、各遺伝子についてそれぞれ完全に自動的に、概日周期変動の有無を判断することができる。

　この判断法を使った判定システムを構築し、４種類の条件下で観察されたマウスの１２４２２個の遺伝子を４時間おきに１２点観察したデータについて、判定を行った。

[坂本83] 坂本, 石黒, 北川, 情報量統計学, 共立出版